کلونینگ و تعیین توالی ژن نورآمینیداز ویروس انفلوانزاh9n2 جدایه اهواز

در این مطالعه توالی نوکلئوتیدی کامل ژن نورآمینیداز سه جدایه 2 خانواده اورتومیکسوویریده در طیور و a گردید. آنفلوآنزا یک عفونت یا یک بیماری است که بوسیله ویروس های تیپ rna. پستانداران ایجاد میشود. ویروس آنفلوآنزا واجد ژنوم هشت قطعهای است که در سنتز ده پروتئین دخالت دارند مورد مطالعه با استفاده از محلول (ahvaz p و 5 ahvaz b و 2 ahvaz g ویروسی از هر یک از سه جدایه ( 1 در حجم نهایی 20 میکرولیتر cdna جداسازی و خالص شد . سپس سنتز ( roche,germany) tripure تجاری 10 میلی مولار ) ، یک میکرولیتر ( 200 واحد ) آنزیم نسخه - ) dntps 2 میکرولیتراز ، rt با استفاده از 4میکرولیتر بافر 1 میکرولیتر ( 50 ،rnase inhibitor 0/5 میکرولیتر ( 20 واحد ) از ،revertaid tm m-mulv بردار معکوس 100 ) صورت پذیرفت. این ng/ml) ویروسی استخراج شده rna و 10 میکرولیتر از forward پیکومول) از پرایمر حاصل در cdna 70° انجام شد . در مرحله بعد c 42° و 10 دقیقه در دمای c واکنش به مدت یک ساعت در دمای ساخته شده، 1 میکرولیتر ( 50 cdna در حجم نهایی 50 میکرولیترو با استفاده از 5 میکرولیتر از ، pcr واکنش 2 واحد / 200 میکرومولار از دزوکسی نوکلئوتیدها ، 1 میکرولیتر ( 5 ، reverse و forward پیکومول) از پرایمر های 50 میلی مولار انجام شد . kcl و (ph 8/ 1 میلی مولار کلرید منیزیم و بافر تریس ( 3 / محلول 5 ،taq ) از پلیمراز برنامه حرارتی استفاده شده ، 3 دقیقه 94 درجه مرحله آغازین،مرحله دوم 94 درجه 30 ثانیه، 56 درجه 30 ثانیه و 72 درجه 1/5 دقیقه به تعداد 40 سیکل ومرحله پایانی 72 درجه 10 دقیقه انجام شد . توالی ژن های نورامینیداز تکثیر یافته در با استفاده از کیت استخراج از روی ژل شرکت کیاژن و مطابق دستورالعمل شرکت سازنده از روی ژل آگارز pcr که محل اثر آنها در پرایمرها قرار داده شده بود، هضم شدند . ecori و sali خالص شده و با آنزیم های محدودالاثر که آن نیز با آنزیم های مشابه هضم شده بود با ptz57r/t و پلاسمید pcr در مرحله بعد، محصولات هضم شده به یکدیگر متصل شدند . سپس این ساختار ها با روش t نسبت مولی 3 به 1 مخلوط و با کمک آنزیم لیگاز 4 انتقال داده شدند . ecoli dh5? ترانسفورماسیون یک مرحله ای پلی اتیلن گلیکول ، معروف به روش چانگ ، به سویه حاوی آمپی س یلین و یا فتن کلونی های مورد نظر، برای هر یک از جدایه های lb پس از غربالگری بر روی محیط آگار مورد آزمایش 3 کلونی برای تعیین توالی انتخاب گردید . مقایسه توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی این جدایه ها با ایران، دیگر کشورهای خاورمیانه و آسیا نشان داد که جدایه های اهو از از h9n یکدیگر و با دیگر جدایه های 2 نظر فیلوژنتیک همراه با جدایه ای جدید از منطقه تهران در گروه فیلوژنیکی مجزایی قرار دارند . بطور کلی انطباق کامل ck/ir/ngv-1/ جدایه های این مطالعه از نظر جایگاه های آمینواسیدی مهم نیز با ویروس 06 دارای منشاء یکسان ck/ir/ngv-1/ دارند. بر این اساس میتوان نتیجه گرفت که جدایه های اهوازو و یروس 06 باشند، اما برای اطمینان از این امر ضروریست که جدایه بیشتری از مناطق مختلف ایران جداسازی و مورد بررسی قرار گیرند.